关于Hydrolab叶绿素、蓝藻探头测量准确程度的说明
摘要：
本文针对Hydrolab多参数水质分析仪的叶绿素和蓝藻探头的原理做了介绍，并对荧光法和实验室标准测量方法进行了简单对比，指明了仪器测量值与实验室分析值之间的差异来源，探讨了影响实际在线监测中的影响因素，并提出一些改善数据质量的办法。
0、引言
Hydrolab由于可以测量叶绿素和蓝藻，可以针对水华现象做出有效预警，在地表水、源水领域有很多应用。环保部门、水利部门以及各地水司、水厂都可以使用该产品对目标水域（主要是湖泊、水库）进行叶绿素和蓝藻的便携测量。但由于对探头测量技术的不熟悉，许多使用者对于该探头的测量精度有误解，使用中也出现了一些问题，造成用户对于探头的准确度产生了怀疑。在此特别针对两个探头的测量技术及实际应用中容易产生的问题做出说明。
1、探头的测量原理
叶绿素和蓝藻探头是基于色素的荧光性测量目标参数的。色素在光谱中有吸收峰和发射峰，利用这一特性，在叶绿素的光谱吸收峰（波长460 nm）发射单色光照射到水中，水中的叶绿素吸收单色光的能量，释放出另外一种波长（发射峰，波长685 nm）的单色光，叶绿素发射的光强与水中叶绿素的含量成正比。
叶绿素、蓝藻探头检测原理图
蓝藻的测量原理同叶绿素a类似，在淡水中测量藻蓝素（藻蓝蛋白，吸收峰590 nm，发射峰650 nm），海水中测量藻红素（藻红蛋白，吸收峰530 nm，发射峰570 nm）。
2、探头的校准
这种荧光法测量色素在探头量程内具有很好的线性度，如下图所示是蓝藻探头针对不同藻类测量得到的曲线。由于叶绿素和蓝藻在不同的藻类中含量差别较大，而探头本身是测量荧光强度的，那么就需要把水中叶绿素和蓝藻的含量与探头测得的荧光强度进行对应，这就是通常的校准过程。
校准时需要从水中提取水样并固定，采用实验室方法对水样中的叶绿素（藻密度）进行分析，然后把探头放到水样中，用实验室分析得到的读数校准仪器。这样，探头测得的荧光强度就和水中的叶绿素（蓝藻）浓度形成了对应关系。可以直接用探头测量水中叶绿素（蓝藻）的浓度。
不同藻类的藻密度与荧光强度的线性关系
由于实验室测叶绿素（蓝藻）比较复杂，有些实验室可能不具备检测条件，因此，可配备二次校准模块对叶绿素（蓝藻）探头进行定期校正。二次校准模块是一个光学模块，可以记录探头的光学特性，在对叶绿素（蓝藻）进行实验室首次校准后，可以用二次校准模块记录校准号的探头参数，然后定期使用二次校准模块将探头参数写回原始探头。一个二次校准模块只能用于一个探头。
3、与实验室方法的对比
荧光法探头测量叶绿素和蓝藻对比实验室分析方法而言，具有速度快、操作简单等特点，尤其适合长期在水中在线测量，以反映水中叶绿素和蓝藻的变化趋势。
但水中叶绿素和藻类分布很不均匀，距离很近的采样点可能叶绿素和藻类浓度相差很多，同一地点不同深度的水体也有很大差异，而探头的尺寸很小，光源和检测窗口的尺寸都只有几个毫米，能够检测到的水体只有探头前面附近的水体，因此探头所测得的实际上是相应物质在探头所在位置的点浓度，而这一点浓度也是随着水流而不断变化的。除此以外，由于探头检测尺寸很小，随着水流、鱼类运动给探头附近带来的气泡、杂质等都会对探头的测量产生影响。因此，在使用时，要根据探头的这一测量特点，采用多点测量，同一点多次测量的方式，尽量减小由于外界因素（如气泡、悬浮物等）给探头带来的影响，在多次测量的结果中去掉坏点，再做平均处理，即可得到比较准确的数据。
对于蓝藻而言，由于实验室测量误差很高，约在20%左右，因此，蓝藻探头也无法得到十分精确的校准。同时，水中蓝藻的种类很多，不同藻类所含的藻蓝素含量也不同，而蓝藻探头实际上是测水中的藻蓝素含量而不能区分蓝藻的种类，因此，探头无法得到十分准确的藻细胞个数。通常只和实验室方法做量级上的对应。
4、荧光法探头稳定性和精度的说明
在进行实验室的对比试验时，有时会发生叶绿素或藻类读数不稳定的情况。这是因为即便是把水样保存在采样瓶或者仪器的校准杯内，水中的藻类分布仍然是不均匀的。由于叶绿素是蕴含在藻类中的，而藻类在水中的分布具有不均匀性（藻类会在水中游动，分布也根据藻类性质的不同有离散或抱团的情况），因此水中的叶绿素和藻类的分布在时间和空间上都具有不均匀性。反映到探头的读数中，就会发现探头读数在一定范围内变化，这是正常现象，所有以在线荧光法作为检测方法的设备都是这样的。这与实验室的叶绿素方法有本质上的区别，在实验室方法中，要把水样中的叶绿素全部萃取出来分析，这样得到的实际上是水体中叶绿素的平均浓度，而这一平均浓度是不能从实际水样中直接得到的。基于上述原因，我们为了排除由于叶绿素和藻类分布不均匀造成的探头读数不稳定的影响，通常在测量前将水样摇匀，并观测多个数据取其平均值。（此时要考虑浊度带来的影响，详见下述）
探头的标称精度为3%，这是指探头测荧光光强的精度为3%，如果水中的响应色素均匀分布，那么我们可以认为，此时探头测量相应色素的精度为3%，但由于上述色素分布的不均匀性，实际使用中，对应的叶绿素和蓝藻的测量精度要低于3%。
5、浊度给荧光法探头带来的影响
浊度对叶绿素读数主要有两种影响：
1.由于光散射增强，空白值会升高。
2.由于光吸收效应，导致荧光值降低。
浊度对荧光值影响的程度主要取决于其浓度水平，可变性和造成浊度环境的混合物成分。轻微、均匀的浊度对活体叶绿素只有微弱影响，但高水平、变化的浊度可显著引起读数误差。一般而言，浊度在50NTU以下不会对探头的读数造成显著影响，可以忽略，但如果水体的浊度在50NTU以上，则需要使用公式对探头的读数进行修正，具体公式见附录，在此不做详述。
6、用质控的办法提高测量精度
对于使用荧光法原理的叶绿素和探头来说，想要提高读数的稳定性和数据质量有以下几种办法。
1、根据现场的实际情况做好探头的维护和保养工作。探头的光学窗口面积狭小，在水中很容易被气泡、污泥以及微生物覆盖，导致探头测量不正确甚至无法测量的情况发生，因此，必须对探头加以保护，如加装铜网等保护装置，使探头尽可能少的受到污染。同时DS5X主机本身具有自清洗功能，应合理设置主机，使其在测量前的1-2分钟能够自动清洗探头表面，该清洗刷最多可以在测量前反复清洗探头9次。此外，定期的探头清理工作也是必须的。
2、利用多次测量的平均值使曲线更加平滑且稳定。由于探头测量的始终是“瞬时点浓度”，为了能让这个浓度值和实际的实验室测得的平均浓度相匹配，可以采用让仪器多次测量取平均值的办法近似的得到稳定性更好的平均浓度值来代替非典型的瞬时点浓度值。
3、利用质控的办法，建立参数的二元回归质控模型，在模型中可以引入实验室测量值、浊度测量值和当前值，利用该模型，对数据进行软处理，使之更加符合实验室的分析结果。模型的具体建立办法见附录。
7、荧光法测量叶绿素和蓝藻的前景
利用荧光法进行色素的测量是一种比较新的方法，目前主要用来测量水中的叶绿素、蓝藻中的藻蓝蛋白和藻红蛋白等少数几种色素，随着荧光技术的不断成熟，更多可测量的色素也会逐渐引入，使得我们可以通过不同色素的含量区分水中的不同藻类，如蓝藻、绿藻、褐藻等（目前也有类似的办法，但是还不是很完善）。除此以外，对于荧光法用于现场测量的稳定性以及影响因素、如浊度等，也可以通过技术手段不断完善，如在探头中增加浊度补偿，改善荧光光源和检测器的灵敏度以得到更好的数据质量等。
8、总结
根据目前的使用情况，荧光法的叶绿素和蓝藻探头可以有效的对源水水质进行在线监测预警，每秒一个读数的极大优势可以使监测者对于水中的藻类生长情况一目了然，根据叶绿素和蓝藻浓度的变化趋势对可能出现的水华做出预警，才去措施消除隐患。但在测量精度方面，叶绿素探头的精度相对较好，在多点测量和多次测量的基础上可以得到比较准确的叶绿素平均浓度，而蓝藻探头一般只和实验室方法做量级上的对应。
